Основан монастырь в 1641 году, когда православный государственный деятель Богдан Стеткевич передал земли под женскую обитель в местечке Барколабово (ныне Быховский район Могилёвской области). Первые монахини прибыли сюда из Кутеинского монастыря, а устроением обители занялся игумен Иоиль Труцевич.

В XVII веке монастырь являлся одним из крупнейших женских монастырей и важным духовным и просветительским центром Восточной Беларуси. Именно здесь была создана знаменитая Барколабовская хроника — памятник белорусского летописания.

Главная святыня обители — чудотворная икона Божией Матери «Барколабовская». По преданию, образ появился в монастыре в 1659 году. Русский князь Симеон Пожарский возвращался из военного похода и вёз с собой икону. Когда обоз подошёл к монастырским воротам, лошади остановились и не могли сдвинуться с места. Князь увидел в этом Божий промысел и оставил образ в обители.

Первоначально икону поместили в центре Вознесенской церкви, но в следующую ночь она чудесным образом переместилась к стене храма. В 1882 году Вознесенский храм сгорел, однако чудотворный образ, иконостас и утварь удалось спасти. В 1885 году была возведена каменная Успенская церковь, куда перенесли святыню.

В Президентской библиотеке Республики Беларусь хранятся сведения об истории Барколабовского монастыря, включая документы о его основании в XVII веке и архивы, связанные с обителью.